Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-11:2011

TCVN 8400-11:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 11: BỆNH DỊCH TẢ VỊT

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 11: Duck virus enteritis disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các nguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp hoặc thất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra môi trường.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả đối với vịt, ngan và ngỗng.

2. Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt sau:

2.1 Thuật ngữ và định nghĩa

Bệnh dịch tả vịt (duck virus enteritis disease)

Bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng các lứa tuổi, do Herpesvirus gây nên, gây viêm niêm mạc đường tiêu hóa và ỉa chảy.

2.2 Chữ viết tắt

- PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polyme)

- Realtime PCR: Realtime Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polyme tức thì)

- DVE (DP): Duck Virus Enteritis Disease (Duck plague) (Bệnh dịch tả vịt)

- VN: Virus Neutralization (Phản ứng trung hòa vi rút với kháng thể chuẩn)

- SN: Serum Neutralization (Phản ứng trung hòa huyết thanh với vi rút giống chuẩn)

- CPE: Cytopathologic Effects (Bệnh tích tế bào)

- FCS: Fetal Calf Serum (Huyết thanh bào thai bê)

- DEF: Duck Embryo Fibroblast (Tế bào xơ phôi vịt)

- NI: Neutralization Index (Chỉ số trung hòa)

- EID₅₀: Embryo Infective Dosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % phôi trứng)

- ELD₅₀: Embryo Lethal Dosage, 50 % (Liều gây chết 50 % phôi trứng)

- TCID₅₀: Tissue Culture Infective Dosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % tế bào)

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Dnase/Rnase, trừ khi có quy định khác.

Xem Phụ lục A về mô tả các môi trường và dung dịch thuốc thử. - Cồn 70 %

- Cồn 96 % đến 100 %

- Giống vi rút dịch tả vịt

- Kháng huyết thanh chuẩn kháng vi rút dịch tả vịt

- Mồi (primers) và mẫu dò (probe) đặc hiệu

- Kit chiết tách ADN

- Kit PCR, realtime PCR

- Phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi

- Phôi trứng vịt từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi.

4. Thiết bị, dụng cụ

- Tủ lạnh thường

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 ^oC

- Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 100 ^oC đến 200 ^oC - Tủ ấp trứng

- Đèn soi trứng

- Nồi hấp ướt.

- Máy ly tâm, có thể hoạt động được ở gia tốc 2000 g

- Máy ly tâm ống nhỏ, có thể hoạt động được ở gia tốc 20000 g - Máy realtime PCR

- Micropipet đơn kênh, dung tích hút từ 0,5 ml đến 10 ml, từ 1 ml đến 20 ml, từ 20 ml đến 200 ml, từ 100 ml đến 1000 ml

- Micropipet đa kênh (dùng pha loãng), dung tích hút từ 5 ml đến 50 ml - Đầu típ phù hợp với các loại micropipet (có lọc và không lọc)

- Ống lấy máu, dung tích 10 ml

- Ống Eppendorf, dung tích từ 1,5 ml đến 2 ml - Bơm tiêm, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml

- Bộ cối chày sứ, có đường kính 6 cm

- Dụng cụ dao, kéo, panh, kẹp, bông...

- Buồng đếm tế bào Neubauer

- Chai nuôi tế bào T25, T75

- Đĩa nuôi tế bào 6 giếng, 24 giếng, 96 giếng.

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

Bệnh dịch tả vịt là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan cho vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi.

Bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng 2 ngày đến 3 ngày.

Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp giữa các vịt khỏe mạnh và vịt bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền qua phân gia cầm mắc bệnh và các dịch tiết từ mũi, miệng và mắt.

Bệnh lây lan nhanh và có thể lây lan dễ dàng bằng phương tiện cơ học như giày dép và quần áo mang từ một đàn bị nhiễm đến.

Bệnh dịch tả vịt có tỷ lệ ốm và chết cao, có thể từ 70 % đến 80 % nếu bị nhiễm lần đầu ở trại không tiêm phòng vacxin dịch tả vịt thường xuyên, kết hợp với vệ sinh không đảm bảo.

5.1.2 Triệu chứng và bệnh tích

Thời gian ủ bệnh thường từ 2 ngày đến 4 ngày tùy theo độc lực của vi rút.

Vịt, ngan, ngỗng bị bệnh có hiện tượng giảm ăn, mất thăng bằng, phân loãng, xù lông, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt sưng. Con vật sợ ánh sáng.

Tuỳ theo trường hợp có thể thấy một hoặc nhiều trong những bệnh tích sau:

- Ở vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc màu hoặc xuất huyết điểm. Con cái có thể thấy các nang trứng bị xuất huyết.

- Mạch máu bị tổn thương. Hệ bạch huyết bị tổn thương và thoái hóa nhu mô.

- Đường tiêu hóa bị viêm, ruột xuất huyết thành từng mảng, có nhiều chất nhờn. Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt.

- Kiểm tra vi thể thấy tổn thương mạch máu và các cơ quan phủ tạng. Xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các tể bào biểu mô của hệ thống tiêu hóa. Đây là biến đổi vi thể điển hình của bệnh.

5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.2.1 Lấy mẫu và bảo quản

- Lấy mẫu vào thời kỳ đầu của ổ dịch. Lấy ngay sau khi con vật ốm, chết hoặc mổ khám. Lấy mẫu theo quy trình tại TCVN 8402:2010 Chẩn đoán bệnh động vật  Quy trình mổ khám.

- Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, thận. Nếu là con vật bệnh hoặc xác mới chết phải lấy từ 3 con đến 5 con. Bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy sau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếu vịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi tiêm 1 tháng để kiểm tra kháng thể bảo hộ.

- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 ^oC đến 8 ^oC. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 h, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.

5.2.2 Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm là phủ tạng lấy từ gia cầm chết, bệnh nghi nhiễm dịch tả vịt được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch nước sinh lý hoặc PBS. Sau đó ly tâm với gia tốc 1000g trong 10 min. Thu lấy dịch nổi, xử lý vô trùng bằng kháng sinh (2000 UI/ml) hoặc lọc qua màng cỡ 0,45 µm. Huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý có thể dùng để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả vịt bằng phản ứng Realtime PCR hoặc phân lập vi rút trên phôi trứng vịt.

Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4 oC đến 8 oC chờ đông rồi chắt lấy huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt.

5.2.3 Phát hiện kháng nguyên

5.2.3.1 Phân lập và giám định vi rút trên phôi trứng vịt

Sử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi để tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý theo 5.2.2. Thu hoạch dịch niệu mô để giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên phôi trứng vịt theo quy định tại Phụ lục B.

5.2.3.2 Phân lập và giám định vi rút trên tế bào xơ phôi vịt

Sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF) để gây nhiễm bằng huyễn dịch bênh phẩm. Thu hoạch dịch nuôi tế bào và giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên môi trường tế bào DEF theo quy định tại Phụ lục C.

5.2.3.3. Kỹ thuật PCR phát hiện vi rút

- Chiết tách ADN của vi rút dịch tả vịt bằng bộ kít chiết tách.

- Làm phản ứng PCR và điện di sản phẩm PCR. Hoặc làm phản ứng realtime PCR theo quy định tại Phụ lục D.

5.2.4 Phát hiện kháng thể

Có thể phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt trong huyết thanh vịt mắc bệnh hoặc đã được tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp trung hòa huyết thanh với vi rút dịch tả vịt rồi tiêm trên phôi trứng vịt hoặc trên tế bào xơ phôi vịt.

5.2.4.1 Phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt

Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 1000 ELD₅₀ (hoặc 100 EID₅₀) vi rút dịch tả vịt.

Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt (mỗi nồng độ tiêm 5 phôi), theo dõi trứng 9 ngày sau đó mổ khám trứng chết và sống kiểm tra bệnh tích phôi.

Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa theo quy định tại Phụ lục B.

5.2.4.2 Phương pháp trung hòa huyết thanh trên tế bào xơ phôi vịt

Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 100 TCID₅₀ vi rút dịch tả vịt.

Gây nhiễm hỗn hợp trên lên tế bào xơ phôi vịt, theo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy. Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa theo quy định tại Phụ lục C.

6 Kết luận

Vịt, ngan, ngỗng được xác định mắc bệnh dịch tả vịt khi có các đặc điểm dịch tế học, triệu chứng lâm sàng của bệnh dịch tả vịt và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phân lập được vi rút trên phôi trứng vịt hoặc tế bào DEF và kết quả giám định dương tính vi rút dịch tả vịt.

- Phản ứng PCR cho kết quả dương tính.

- Phản ứng realtime PCR dương tính.

- Đối với con vật chưa tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt có kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt hoặc trên tế bào DEF.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch PBSx10

Thành phần:

NaCl                                                                 80,0 g

KCl                                                                   2,0 g

Na₂HPO₄                                                           11,5 g

KH₂PO₄                                                             2,0 g

Pha loãng với 1000 ml nước, điều chỉnh pH 7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 ^oC.

A.2 Dung dịch NaHCO₃ 7 %

Thành phần:

NaHCO₃                                                            7,0 g

Nước                                                                100 ml

Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 ^oC.

A.3 Dung dịch L-glutamine 3 %

Thành phần:

L-glutamin                                                         3 g

Nước                                                                100 ml

Dung dịch đã pha được lọc vô trùng. Bảo quản ở -20^oC.

A.4 Canh thang TPB (tryptose phosphate broth)

Thành phần:

Tryptoza phosphat                                            29,5 g

Nước                                                                1000 ml

Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 ^oC.

A.5 Trypsin 2,5 % (10x)

Thành phần:

Trypsin                                                             2,5 g

PBS                                                                 100 ml

Lắc qua đêm ở 4oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20 oC.

A.6 Môi trường nuôi cấy tế bào MEM

Thành phần:

Môi trường MEM (Eagle’s minimum                   430 ml

essential medium)

Tryptoza phosphat broth (TPB)                          50 ml

L-glutamin 3 %                                                  5 ml

NaHCO3 7 %                                                     5 ml

Kháng sinh (penicillin + streptomycin)                 5 ml

FCS                                                                  5 ml

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI RÚT DỊCH TẢ VỊT TRÊN PHÔI TRỨNG VỊT

B.1 Phân lập vi rút

a) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt:

- Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi (không có kháng thể kháng dịch tả vịt), lấy từ trại vịt sạch bệnh.

- Soi trứng, chọn phôi khoẻ. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi.

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %. Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi.

- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm đã xử lý vô trùng (bằng kháng sinh hoặc qua màng lọc 0,45 µm) rồi tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô.

- Gắn kín lỗ tiêm bằng keo.

- Ấp tiếp ở nhiệt độ từ 37oC đến 38oC. Mỗi ngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 h. Theo dõi 10 ngày sau tiêm.

- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết được bảo quản ở nhiệt độ 4 oC. Phôi nhiễm vi rút dịch tả vịt cường độc thường chết từ 3 ngày đến 8 ngày sau khi tiêm.

- Sau 10 ngày, các trứng không chết được giữ ở 4 oC để giết phôi.

b) Thu hoạch nước trứng

- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng. Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %.

- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô.

- Hút nước trứng vào ống Eppendorf vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 4 oC để kiểm tra.

B.2 Giám định vi rút

Dùng phương pháp trung hòa vi rút trên phôi trứng vịt.

- Pha loãng dịch niệu mô thu hoạch ở trên thành các nồng độ 10-1 đến 10-9 với dung dịch PBS.

- Lô đối chứng dương: trộn huyết thanh chuẩn kháng dịch tả vịt với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 h.

- Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi, liều 0,2 ml/phôi; mỗi nồng độ tiêm 5 trứng.

- Ấp trứng trong tủ ấm 37oC theo dõi trong 10 ngày. Loại bỏ trứng chết trong vòng 24 h. Ghi chép số phôi chết.

- Nếu có vi rút dịch tả vịt lô đối chứng dương phôi sẽ sống, lô đối chứng âm phôi sẽ chết trong khoảng 3 ngày đến 8 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

- Dựa vào tỷ lệ sống chết của phôi để tính toán liều ELD50 (hoặc EID50) và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa ELD50 (hoặc EID50) của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính.

- Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

VÍ DỤ: Thí nghiệm có kết quả chuẩn độ liều ELD50 của vi rút dịch tả vịt như sau:

Công thức Reed & Muench:

Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là 10 -7,7.

Tính chỉ số trung hòa:

Kết quả: NI = 6,5 - 2,5 = 4,0

Kết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả vịt.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI RÚT DỊCH TẢ VỊT TRÊN TẾ BÀO

C.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck Embryo Fibroblast)

- Chọn trứng vịt có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi, phát triển tốt. Mổ trứng, lấy phôi. - Rửa phôi trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng.

- Rửa lại phôi từ 1 lần đến 2 lần trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh. - Cắt nhỏ phôi.

- Tách tế bào bằng dung dịch trypsin ấm 0,25 % và lắc nhẹ 250 r/min trong 15 min.

- Thu hoạch tế bào đă tách bằng cách lọc qua 4 lần vải gạc, cho vào môi trường MEM.

- Ly tâm huyễn dịch tế bào với gia tốc 1500 g, trong 5 min ở 4 oC, loại bỏ phần nước trong. - Rửa lại 1 lần với môi trường nuôi cấy.

- Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10 % FCS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4 x 105 tế bào/ml.

C.2 Phân lập vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

- Cấy tế bào DEF trên các chai nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi tế bào (đĩa 6 giếng, 24 giếng), sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý, lượng 100 µl/giếng hoặc 500 µl/chai. Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập.

- Quan sát CPE trong các chai nuôi cấy thời gian 7 ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày. Nếu CPE đạt 70 % đến 80 % hoặc sau 7 ngày không có CPE thì tiến hành thu hoạch hỗn dịch tế bào.

- Cho các chai nuôi cấy vào nhiệt độ -20 oC đến -40 oC làm đông, sau đó giải đông, lặp lại 3 lần, cuối cùng ly tâm và thu phần nước trong để giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.

C.3 Giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

a) Chuẩn bị

Tế bào DEF đă nuôi cấy được 2 ngày đến 3 ngày trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

Pha loãng vi rút phân lập: các nồng độ từ 10-1 đến 10-9 với môi trường nuôi cấy MEM.

Lô đối chứng dương tính: trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đă pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

Lô đối chứng âm tính: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ vi rút đă pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

b) Tiến hành

Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đă nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, 8 giếng/nồng độ. Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37 oC trong 1 h.

Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100 µl/giếng.

Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC, thời gian từ 7 ngày đến 9 ngày.

Hàng ngày kiểm tra CPE , thường vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.

c) Đánh giá kết quả

Dựa vào kết quả CPE của 2 lô để tính toán liều TCID50 và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa TCID50 của lô đôi chứng dương tính và lô đối chứng âm tính. Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

PHỤ LỤC D

(Quy định)

PHÁT HIỆN VI RÚT DỊCH TẢ VỊT BẰNG PHẢN ỨNG PCR

D.1 Chiết tách DNA của vi rút từ mẫu bệnh phẩm

Chiết tách bằng kit theo quy trình của nhà sản xuất. Dưới đây là hướng dẫn của bộ kit chiết tách QIAamp DNeasy Blood & Tissue Mini Kit.

- Nhỏ 20 µl protease vào ống 1,5 ml.

- Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống. 

- Nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống.

- Lắc ống trong 15 s và ly tâm ở 350g trong 15 s (spin down). - Ủ ở 56 oC trong 10 min rồi ly tâm ở 350g trong 15 s.

- Nhỏ 200 µl cồn 96 % đến 100 % vào ống, lắc đều trong 15 s rồi ly tâm 350g trong 15 s. - Chuyển toàn bộ dịch trong ống vào cột lọc có ống thu.

- Ly tâm cột lọc và ống thu với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc, ly tâm với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc, ly tâm với tốc độ 20000g trong 3 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml không có Dnase.

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 min.

- Ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống 1,5 ml.

- Bảo quản ống ở 4 oC nếu làm PCR ngay, hoặc ở - 20 oC nếu làm PCR sau 24 h.

D.2 Kỹ thuật PCR

a) Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kit nhân gen PCR.

b) Sử dụng cặp mồi (primers) đặc hiệu phát hiện gen của vi rút dịch tả vịt.

Trình tự cặp mồi dùng để phát hiện vi rút dịch tả vịt bằng kỹ thuật PCR

Chu trình nhân gen

c) Chạy điện di sản phẩm PCR:

Pha thạch Agar 1 % bằng dung dịch đệm TAE, đun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược) Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điện di có đệm TAE

Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading với tỷ lệ 1:10, trộn lẫn với ethidi bromua và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch agar (10 µl/mẫu)

Chạy điện di trong 1 h ở điện thế 120 V.

Rửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước 45 min và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh.

d) Đọc kết quả:

- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính có vạch với kích cỡ 446 bp -

Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không có vạch.

D.3 Kỹ thuật Real-time PCR

Sử dụng kỹ thuật Real-time PCR với SYBR Geen: dùng cặp mồi (primers) như trên với các nguyên liệu cho Real-time PCR, ví dụ của bộ kit QuantiFast SYBR PCR (hãng Qiagen).

Lượng chất phản ứng cho 1 mẫu như sau:

2x Master mix                                                   12,5 µl

H₂O                                                                  6,5 µl

Mồi xuôi (20 µM)                                               0,5 µl

Mồi ngược (20 µM)                                            0,5 µl

Kết quả rPCR được hiển thị qua chương trình phần mềm của máy tính:

- Mẫu dương tính có giá trị Ct, mẫu âm tính không có.

- Mẫu đối chứng dương có giá trị Ct như đã biết qua định lượng (± 2 Ct)

- Mẫu đối chứng âm không có giá trị Ct.