Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN5617:1991

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5617:1991

NGŨ CỐC

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN

Cereals -

Method for determination of aflatoxins

TCVN 5617-1991 có trích dẫn tham khảo một số điều cibm quy định trong TCVN 4804-89 thức ăn gia súc. Phương pháp xác định aflatoxin.

TCVN 5617-1991 do Viện Dinh dưỡng biên soạn, Bộ Y tế đề nghị ban hành, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng - trình duyệt và được Uỷ ban Khoa học nhà nước ban hành theo quyết định số 894/QĐ ngày 31 tháng 12 năm 1991.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2, trong các sản phẩm ngũ cốc. Phương pháp này có thể áp dụng cho hạt đậu và bột đậu, lạc và các sản phẩm của lạc.

Giới hạn phát hiện là 5 mg/kg.

1. Nguyên lý của phương pháp:

Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần xác định dịch lọc, được làm sạch qua cột silicagel. Để bay hơi dịch phản hấp phụ và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen-axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định aflatoxin của mẫu thử trên sắc ký lớp mỏng và so sánh Rf, màu sắc và mật độ huỳnh quang với dung dịch aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang.

2. Hoá chất, thuốc thử:

Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác.

2.1. Axeton

2.2. Clorofoc

2.3. n-hexan

2.4. Ete êtylic khan

2.5. Metanol

2.6. Axetonitril

2.7. Benzen

2.8. Natri sunfat khan

2.9. Celite 545, diatomaceous earth

2.10. Axit sunfuric 50% (v/v)

2.11. Axit trifluoraxetic

2.12. Khí nitơ

2.13. Bông hút nước (được loại béo bằng clorofoc) hoặc bông thuỷ tinh

2.14. Các hệ dung môi khai triển:

- Clorofoc/axeton: 9/1 (v/v)

- Ete êtylic/metanol/nước: 94/4, 5/1,5 (v/v/v)

- Clorofoc/axeton/isopropanol/nước: 88/12/1,5/1 (v/v/v/v)

- Toluen/êtyl axetat/axit focmic: 6/3/1 (v/v/v)

2.15. Silicagel G-60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 - 0,2mm (63-200 mesh). Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105 oC trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút mài, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc cho đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín.

2.16. Silicagel dùng cho sắc ký lớp mỏng: silicagel 60-GHR, 60-H, 60-G.

2.17. Chuẩn bị dung dịch Aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng).

2.17.1. Dung dịch aflatoxin chuẩn đậm đặc (dung dịch A):

Cân 1mg mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch hỗn hợp benzen-axetonitril 98:2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10mg/ml).

2.17.2. Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B):

Cho vào bình định mức 10ml lần lượt 0,5ml aflatoxin B1, 0,5ml aflatoxin G1, 0,1ml aflatoxin B2, 0,1ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp benzen- axetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 mg/ml đối với B1, G1, và 0,1mg/ml đối với B2, G2.

2.17.3. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ, bước sóng từ 330-370nm, tính kết quả theo công thức: 

Trong đó:

F - hệ số hiệu chỉnh quang phổ kế (0,95 - 1,05).

m - khối lượng phân tử aflatoxin

A - mật độ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại

e - độ hấp thụ phân tử của aflatoxin

2.17.4. Bảo quản:

+ Bảo quản ở 0 oC, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần.

+ Cân bình thuỷ tinh chứa dung dịch chuẩn và ghi lại số lượng cân trước khi để vào tủ lạnh. Khi sử dụng lại dung dịch, lấy bình ở tủ lạnh ra và để ở nhiệt độ phòng, lau sạch nước ngưng tụ xung quanh bình; sau đó cân lại bình. Bất kỳ sự thay đổi khối lượng nào đều ứng với sự thay đổi nồng độ do dung môi bay hơi. Phải bổ sung dung môi cho đến khi đạt được trọng lượng của bình trước khi bảo quản, và cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn đậm đặc (dung dịch A) mỗi khi sử dụng.

3. Thiết bị:

3.1. Máy xay nghiền mẫu

3.2. Máy lắc hoặc máy khuấy từ

3.3. Cân phân tích.

3.4. Máy cất quay chân không.

3.5. Bếp cách thuỷ.

3.6. Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm.

3.7. Quang phổ kế.

3.8. Máy đo mật độ huỳnh quang.

3.9. Các trang bị của sắc ký lớp mỏng.

3.10. Cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khoá nút mài thuỷ tinh hoặc Teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250 ml.

3.11. Bình nón nút mài 250 ml, 500ml.

3.12. ống đong 50ml, 100ml.

3.13. Phễu lọc, đường kính 8-10cm.

3.14. Micropipet Hamilton.

3.15. Tấm thuỷ tinh 20 x 20 cm. Chuẩn bị lớp mỏng như sau: Các tấm thuỷ tinh phải được rửa sạch, ngâm trong dung dịch sunfocromic, sau đó phải rửa nhiều lần bằng nước sạch, tráng lại nhiều lần bằng nước cất, sấy khô. Cân 30g silicagel dùng cho sắc ký lớp mỏng (2-15) cho vào bình nón 250ml, thêm 60ml nước cất. Đậy nút và lắc trong 1 phút. Rải hỗn hợp trên lên các bản mỏng sao cho thu được lớp mỏng silicagel đồng nhất, có độ dày là 0,25mm (lượng silicagel trên đủ cho 4 bản 20 x 20cm). Để yên 10 phút. Để khô ở không khí và bảo quản ở bình hút ẩm. Trước khi dùng hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ.

Chú ý: Bản mỏng chuẩn bị sẵn cũng phải được hoạt hoá trước khi dùng.

4. Chuẩn bị thử:

(Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng).

4.1. Chuẩn bị mẫu:

Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm.

Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng béo lớn hơn 5%, cần loại béo với dung môi ê te dầu hoả (độ sôi 40 – 60 oC) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu.

4.2. Chiết suất:

Cân 50g mẫu đã nghiền nhỏ cho vào bình nút mài 500 ml. Cho tiếp 25 ml nước, 25 g celite 545, 250 ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc dầu sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10 g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Buchner có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và dùng hút chân không.

4.3. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký:

Chuẩn bị cột sắc ký:

Cho một nhóm bông vào đáy cột sắc ký thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (2-15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên.

Trộn 50ml dịch lọc trên (4-2) với 150 ml n-hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150 ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 - 12ml/phút.

Phản hấp thụ aflatoxin bằng 150ml hỗn hợp metanol-clorofoc (3:97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho hỗn hợp phản hấp phụ cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dịch phản hấp phụ bằng máy cất quay chân không cho đến khi còn khoảng 2-3ml ở nhiệt độ thấp hơn 50 oC. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 50 oC, tốt nhất dưới luồng khí nitơ nhẹ. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng.

5. Tiến hành thử:

5.1. Sắc ký lớp mỏng một chiều:

5.1.1. Chuẩn bị:

Hoà cặn thu được ở trên với 0,5 ml hỗn hợp benzen-axetonitril (98:2) để chấm sắc ký.

Với bản mỏng tự chuẩn bị trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2cm và cách nhau 2cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau:

1) Lấy 2; 5; 10; 20m1 dung dịch chuẩn aflatoxin B (2-17-2).

2) Lấy 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch chuẩn aflatoxin B (2-17-2)

3) Lấy 10, 20 ml dịch chiết.

- Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau.

Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc-axeton (9:1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10 cm, lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây.

5.1.2. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin:

Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm.

Rót dung dịch iốt 5-10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20 cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai , cách khoảng 1 cm trong thời gian 20-30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin.

Chia bản mỏng silicagel 20 x 20cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thử và dung dịch aflatoxin chuẩn như sau:

Phần 1: (Bên trái)

1) 10 m1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

2) 10 m1 dịch chiết

3) 10 m1 dịch chiết với 10 1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

4) 10 m1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

Phần 2: (Bên phải)

5) 10 m1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

6) 10 m1 dịch chiết

7) 10 m1 dịch chiết với 10 m1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

8) 10 m1 dung dịch aflatoxin chuẩn (2-17-2)

Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần1 bên trái, mỗi vết một giọt axit trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axit sunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển.

Dung môi khai triển: Nước/metanol/ete etylic - 1/3/96.

Khi dung môi lên khoảng 13cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, cách đèn 10cm.

Nhận xét kết quả:

- Nửa bên trái: các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh lơ.

- Nửa bên phải: các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang màu xanh lơ chuyển sang màu vàng.

5.1.3. Định lượng

5.1.3.1. Bằng mắt:

Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.

Vết huỳnh quang của vết chấm chồng dung dịch aflatoxin chuẩn lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 m1 dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ huỳnh quang của vết 10 m1 dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20ml dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại.

Tính kết quả

Hàm lượng aflatoxin tính bằng Microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức:

Trong đó:

S- Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn (2-17-2), mg/ml

V- Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, m1.

W- Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, g.

X- Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn chấm trên bản mỏng, ml.

Y- Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết chấm trên bản mỏng, m1.

5.1.3.2. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang.

Bước sóng kích thích là 365 nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.

Tính kết quả.

Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính như sau:

Trong đó:

Y - Thể tích của dịch chiết mẫu chấm trên bản mỏng ( 10 ml hoặc 20 ml), ml.

S - Hàm lượng aflatoxin của vết chấm dịch chiết, ng.

V- Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ml.

W- Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, g.

5.2. Sắc ký lớp mỏng hai chiều:

5. 2.1. Chuẩn bị:

Khi có các chất làm cản trở cho việc xác định aflatoxin, cần tiến hành phân tích theo phương pháp sắc ký lớp mỏng hai chiều.

Hoá chất, thuốc thử, dụng cụ thiết bị, chuẩn bị mẫu, chiết xuất, làm sạch qua cột như ở phần sắc ký lớp mỏng một chiều.

Dùng một que nhọn kẻ hai đường thẳng giao nhau và song song với hai cạnh của bản mỏng, đường 1 cách cạnh 5cm, đường 2 cách 6cm (hình vẽ trên) để giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng micropi-pet chấm các dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn aflatoxin theo sơ đồ:

- ở điểm A, 20 ml dịch chiết đã được làm sạch.

- ở điểm B, 10 ml dung dịch chuẩn (2-17-2).

- ở điểm C, 5 ml dung dịch chuẩn (2-17-2).

- ở điểm D, 10 ml dung dịch chuẩn (2-17-2).

- ở điểm E, 20 ml dung dịch chuẩn (2-17-2).

Các vết chấm thu được phải có đường kính nhỏ hơn 5mm.

5.2.2. Khai triển

- Chiều 1: Bình được bão hoà bằng một lớp dung môi 1 cm là hỗn hợp ête êtylic-metanol-nước với tỷ lệ 94/4,5/1,5 (hoặc hệ dung môi có tác dụng tương đương). Khai triển ở chỗ tối tới khi tiếp tuyến dung môi đạt tới đường giới hạn. Lấy bản mỏng ra khỏi bình khai triển, để khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút ở chỗ tối.

- Chiều 2: Bình không bão hoà, lớp dung môi 1 cm là hỗn hợp clorofoc-axeton với tỷ lệ 9/1 (hoặc hệ dung môi có tác dụng tương đương). Cho bản mỏng đã để khô ở trên bình khai triển và cho dung môi đi lên theo chiều 2 (hình vẽ trên). Khai triển ở chỗ tối cho tới khi tiếp tuyến dung môi đạt tới đường giới hạn. Lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

Soi bản sắc ký dưới đèn tử ngoại, cách đèn 10 cm, ở bước sóng 365nm. Theo lý thuyết, vết huỳnh quang của dịch chiết mẫu thử chấm ở điểm A sẽ tiến đến điểm P, nhưng trong thực tế đôi khi chúng được tìm thấy ở điểm A, do đó cần làm bước tiếp theo là sắc ký bổ sung.

5.2.3. Sắc ký bổ sung

Tiến hành làm lại một bản sắc ký mới như ở phần 5.2, chỉ khác ở chỗ chấm chồng lên chấm dịch chiết ở điểm A 10 ml dung dịch chuẩn. Thao tác và điều kiện khai triển như phần sắc ký lớp mỏng hai chiều. Soi bản sắc ký dưới đèn tử ngoại, cách đèn 10 cm, ở bước sóng 365nm và kiểm tra:

- Vết huỳnh quang aflatoxin của dịch chiết và của dung dịch chuẩn phải trùng nhau.

- Huỳnh quang của vết này phải mạnh hơn huỳnh quang của vết aflatoxin đã khai triển ở điểm Q của bản mỏng thứ nhất.

5.2.4. Định lượng

5.2.4.1. Bằng mắt

Xác định hàm lượng aflatoxin bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết mẫu (A) với mật độ huỳnh quang của các vết dung dịch chuẩn (C,D,E). Nếu mật độ huỳnh quang của vết 20 ml dịch chiết mẫu mạnh hơn mật độ huỳnh quang của vết 20 ml dung dịch chuẩn, pha loãng dịch chiết và tiến hành sắc ký lại.

Tính kết quả: như ở phần sắc ký lớp mỏng một chiều - định lượng aflatoxin bằng mắt.

5.2.4.2. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang:

Sử dụng máy đo mật độ huỳnh quang với bước sóng kích thích là 365nm, bước sóng phát xạ là 443nm. Xác định hàm lượng aflatoxin của vết dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn ở C, D, E.

Tính kết quả: Như ở phần sắc ký lớp mỏng 1 chiều - định lượng aflatoxin bằng máy.