Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN6168:1996

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6168:1996

PHÂN BÓN VI SINH VẬT GIẢI XENLULOZA

Cellulose-degraing microbial fertilizer

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các lại phân bón các chủng vi sinh vật sống có khả năng phân giải xenlluloza và quy định các yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm tra đánh giá đối với phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza.

2. Tiêu chuẩn trích dẫn

TCVN 4833-89 (iso 4833-1978) Hướng dẫn chung đếm vi sinh vật kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30⁰C

TCVN 4881-89 (ISO 6887-1983 )Hướng dẫn chung về cách pha chế dung dịch pha loăng để kiểm nghiệm vi sinh vật

TCVN 5814 -1994 Phân bón hỗn hợp NPK. Phương pháp thử

TCVN 6169-1996 Phân bón vi sinh vật. Thuật ngữ

3. Thuật ngữ, định nghĩa

Phân bón vi sinh vật phân giả xenluloza là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đă được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn hiện hành có khả năng phân giải xenluloza, qua đó cung cấp chất dinh dưỡng cho đất và cậy trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và ( hoặc) chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ của đất. Phân vi sinh vật phân giải xenluloza và các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.

4. Yêu cầu kỹ thuật

4.1 Phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza phải chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phát triển trên môi trường chứa nguồn cacbon duy nhầt là xenluloza tự nhiên

4.2 Phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza có mật độ vi sinh vật sống phù hợp với quy định trong bảng 1

Bảng1 - Mật độ vi sinh vật

CFU*: Đơn vị h́nh thành khuẩn lạc

4.3 Phân vi sinh vật phân giải xenluloza phải có tác dụng tốt đối với đất và cây trồng. Hiệu quả của phân bón phải đạt các chỉ tiêu chất lượng đă ghi trên nhăn và được xác định tại pḥng thử nghiệm được công nhận hoặc chỉ định

4.4 Độ an toàn của các chủng vi sinh vật chứa trong phân phải được xác định và công nhận tại các pḥng thử nghiệm được công nhận hoặc chỉ định

4.5 Thơi gian boat hành của phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza không ít hơn 6 tháng kể từ ngày xuất xưởng

4.6 Hàm lượng các chất dinh dưỡng và độ ẩm của phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza phải được đăng kư tại các cơ qun quản lư nhà nước về chất lượng và được xác định đánh giá tại các pḥng thí nghiệm được công nhận hoặc chỉ định

5 Lấy mẫu

5.1 Quy định chung

5.1.1 Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tran phải là mẫu đại diện cho cả lô hàng. Người lấy mẫu phải được huẩn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu

5.1.2 Trong quá tŕnh lấy mẫu, vận chuyển và xử lư mẫu, phải đảm bảo tránh sự lây nhiễm từ bên ngoài và phải bảo đảm là mẫu được nguyên trạng như ban đwuf cho tới khi đem phân tích trong pḥng thí nghiệm

5. 1.3 Không được bổ xung thêm bất cứ một tác nhận bảo quản, diệt khuẩn hoặc diệt nấm vào mẫu kiểm tra.

5.1.4 Mẫu được lấy phải là các bao nguyên gói.

5.1.5 Phải tiến hành lấy mẫu ở những nơi không có hơi nước nóng, hoá chất độc hại, không có ánh nắng gay gắt hoặc bụi và được đưa ngay vào các dụng cụ chứa mẫu.

5.1.6 Các dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải sạch sẽ và vô trùng

5.2 Chuẩn bị dụng cụ lấy và chứa mẫu

5.2.1 Dụng cụ lấy mẫu phải là loại được làm từ thép không rỉ hoặc bằng thuỷ tinh

5.2.2 Các dụng cụ lấy và chứa mẫu sạch sẽ và vô trùng bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170⁰C trong thời gian không ít hơn 1giờ hoặc trong nồi hấp ở nhiệt độ 121⁰ C trong thời gian không ít hơn 30 min và được bảo quản trong các dụng cụ thích hợp, đảm bảo tránh lây nhiễm từ bên ngoài.

5.3 Số lượng mẫu

5.3.1 Lô hàng bao gồm các bao ( túi ) sản phẩm phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza được sản xuất cùng một đợt với cùng một nguồn nguyên liệu.

5.3.2 Số lượng bao ( túi) cần lấy để kiểm tra đối với mỗi lô hàng phụ thuộc và độ lớn của lô hàng đó và phù hợp với quy định trong bảng 2.

Bảng 2- Số lượng bao ( túi ) cần lấy để kiểm tra

5.3.3 Các bao ( túi ) mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên theo TCVN 1694-75

Tiến hành lấy mẫu trung b́nh từ mẫu chung là tập hợp các mẫu ban đầu trong lô hàng kiểm tra. Chia mẫu trung b́nh làm 2 phần bằng nhau rồi bao gói phù hợp với yêu cầu của sản phẩm. Một phần dùng để kiểm tra và một phần để lưu và bảo quản trong điều kiện qui định mà mỗi loại sản phẩm yêu cầu để dùng khi phân tích trọng tài.

Trên mỗi gói mẫu phải có nhăn ghi rơ:

- tên mẫu và đối tượng cây trồng được sử dụng;

- tên cơ sở sản xuất;

- thời gian sản xuất;

- thời gian và địa điểm lấy mẫu;

- tên người lấy mẫu , cơ quan lấy mẫu.

6. Tiến hành kiểm tra và xác định

6.1 Chuẩn bị kiểm tra

6.2.1.1 Trang thiết bị , dụng cụ kiểm tra

Trang thiết bị của pḥng kiểm nghiệm vi sinh vật thông thường bao gồm:

- thiết bị để khử trùng khô ( tủ sấy ) hoặc khử trùng hơi nước, (nồi hấp)

- tủ ấm, có thể điều chỉnh được ở 30 ⁰ C ± 1 ⁰C;

- hộp lồng thuỷ tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 đến 100 mm;

- pipet thuỷ tinh có dung tích 1,0 ml; 5,0 ml; 10,0 ml;

- máy đếm khuẩn lạc có đáy được chiếu sáng với nền tối có gắn một thấu kính phóng đại , ở độ phóng đại 1,5 lần và một dụng cụ đếm cơ học hoặc hiện số điện tử;

- máy đo độ pH có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị đo pH

- nồi cách thuỷ ổn nhiệt;

- ống nghiệm thuỷ tinh 18 x 18 mm;

- b́nh tam giác có dung tích thích hợp;

- ống đong và các dụng cụ thuỷ tinh khác

Các dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải khử trùng bằng cách:

- giữ ở từ 170 đến 175⁰ C không ít hơn 1 h trong tủ sấy, hoặc

- giữ ở áp suất 1,0 atmotphe ( 121⁰ C) không ít hơn 30 min trong nồi hấp

Các thiết bị pha trộn

- máy trộn quay có tần số quay từ 8 000 đến 45 000 ṿng / min, có b́nh chứa bằng kim loại hoặc thuỷ tinh, chịu được các điều kiện tiệt trùng;

- dụng cụ trộn nhu động ( stomacher) với các túi chất dẻo đă vô trùng;

- dụng cụ trộn : có thể trộn từ 1 ml đến 2 ml mẫu thử;

- cân kỹ thuật có độ chính xác tới 0,01 g.

6.2.1.2 Dịch pha loăng được dùng là dung dịch muối ăn ( NaCl) 0,85 %, không chứa các hợp chất cacbon, có độ pH là 7,0 sau khi khử trùng ở 25 ⁰C.

Lấy 90 ml dịch pha loăng vào các b́nh cầu hoặc lọ bằng chất dẻo ( cho dịch huyền phù ban đầu ), hoặc

Lấy 9 ml dịch pha loăng vào ống nghiệm ( cho ccs dịch pha loăng thập phân)

Nút lại bằng bông mỡ, khử trùng trong nồi hấp ap lực ở 121⁰C trong 30 min.

Nếu chứa sử dụng ngay, dịch pha loăng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5⁰ C, thời gian bảo qủn không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.

Chú thích - Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên diều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loăng đến nhiệt độ pḥng thử nghiệm

6.2.1.3 Chuẩn bị môi trường kiểm tra

Môi trường dùng để kiểm tra phân vi sinh vật phân giải xenluloza được sử dụng là môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là xenluloza tự nhiên, thành phần môi trường phụ thuộc vào chủng loại vi sinh vật mà nhà sản xuất sử dụng. Nếu không có yêu cầu của nhà sản xuất, khi kiểm tra sử dụng môi trường theo phụ lục A.

Môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đă cho và chia vào các dụng cụ thuỷ tinh đă chuẩn bih trước ṛi khử trùng ở điều kiện 1 atmotphe ( 121⁰ C) trong 30 min. Phan chia môi trườn vào các hộp lồng đă khử trùng ở điều kiện vô trùng. Kiểm tra độ sạch của môi trường sau 2 ngày để ở nhiệt độ từ 28 đến 30⁰C. Chỉ sử dụng các hộp lồng chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật không phát hiện thấy tạp nhiễm.

Chú thích- đối với phân vi sinh vật phân giải xenluloza chứa các vi sinh vật dưới dạng tiềm sinh, trước khi kiểm tra cần phải hoạt hoá.

6.2.1.4 Chuẩn bị dịch huyền phù xenluloza.

Cân 30 g giấy lọc loại định lượng ( thí dụ Whatman 1 ) xé thành mảnh nhỏ cho vào b́nh thuỷ tinh có dung tích 4 lit, thêm một lit nước cất và một ít viên bi thuỷ tinh sao cho đủ ngập giấy. Lắp b́nh vào máy lắc, lắc cơ học với tôc độ 74 lần/ min trong khoảng 30 min, để lắng sau 24 h , chắt lấy dung dịch huyền phú xenluloza.

6.2.1.5 Chuẩn bị dung dịch chỉ thị Benedict:

Thành phần dung dịch Benedict;

Natri xitrat 17, 3 g

Na₂ CO₃ 10, 0 g

CuSO₄. 7H₂O 1, 73 G

- hoà tan natri xitrat và Na₂CO₃ vào 80 ml nước ấm. Bổ xung nước cất vừa đủ để đạt 85 ml ( dung dịch A)

- hoà tan CuSO₄ vào 10 ml nước ( dung dịch B)

- trộn đều dung dịch A và dung dịch B;

- bổ xung nươc vừa đủ để đạt 100 ml.

6.2.2 Tiến hành kiểm tra

6.2.2.1 Pha loăng mẫu

a) đối với mẫu dạng lỏng: dùng pipet vô trùng có nút bông ở phần nút lấy ra 10 ml mẫu đă trộn đều bằng lắc tay hay thiết bị lắc cỏ học và đưa vào 90 ml dịch pha loăng theo 6.2.1.2. Chú ư tránh chạm pipet vào dịch pha loăng, trộn cẩn thận mẫu đă chuẩn bị bằng cách hút- thả lại 10 lần với một pipet có nút bông ở phần hút đă vô trùng khác hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5 10 s, nhịp quay của dụng cụ này được chọn sao cho mẫu trộn như cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2 đến 3 cm. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu.

b) đói với mẫu dạng đặc biệt: cân 10 g mẫu có độ chính xác tới 0,01 g và cho vào b́nh chứa vô trùng, thêm 90 ml dịch pha loăng trong 6.1.1.2. Đặt b́nh vào máy trộn trong 2 đến 5 min sao cho có được một dung dịch có phân bố đồng đều, để lắng cá phân tử nặng trong khoảng 15 min, gạn được dung dịch huyền phù ban đầu.

c) dùng một pipet đă vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù ban đầu ( a hoặc b) cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loăng ( 6.2.1.2 ) đă chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ pḥng, tránh chạm pipet vào dịch pha laơng. Trộn kỹ bằng cách hút - thả khoảng 10 lần với một pipet khác có nút bông ở đầu hút đă vô trùng, để có dịch pha loăng mẫu có nồng độ là 10^-2. Qúa tŕnh này được lậpp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha laơng theo quy định sau:

- đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng sư dụng nồng độ pha loăng là 10 ^-7.

- đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng sử dụng nồng độ pha loăng là 10^-5.

6.2.2.2 Cấy mẫu

Dùng pipet vô trùng riêng cho từng độ pha loăng riêng lấy ra từ dịch mẫu có nồng độ pha loăng 10^-5. 10^-6; 10^-7 đối với mẫu phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng; 10^-3; 10^-4; 10^-5 đối với mẫu phân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng, một lượng dịch mẫu 0,05 ml, cấy vào 1 hộp lồng chứa môi trường đă chuẩn bị sẵn theo 6.2.1.3. Mỗi mẫu được cấy lập lại trên hai hộp lồng.

Nhắc nhẹ hộp lồng để dịch mẫu dàn trải trên bề mặt thạch , chú ư không để dịch mẫu dính vào thành hộp lồng, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược hộp lồng và đưa vào tủ ấm, điều chỉnh nhiệt độ tủ ấm cho phù hợp với yêu cầu của từng loại vi sinh vật. Thời gian nuôi là 48 -72 h.

6.2.2.3 Phát hiện ṿng phân giải

Lấy 1 ml huyền phù xenluloza và 1 ml dung dịch chỉ thị Benedict nhỏ lên bề mặt thạch đă cấy mẫu ( 6.2.2.2) để ở nhiệt độ 30 đến 35⁰ C trong 10 đến 15 min.

Quan sát ṿng phân giải trong suốt bao quanh các khuẩn lạc phân giải xenluloza

6.2.3 Đọc kết quả`

Vi sinh vật phân giải xenluloza được tính là số khuẩn lạc trong hộp lồng tạo vạng phân giải ( ṿng tṛn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc.

Vi sinh vật tạp là tất cả các khuẩn lạc không có đặc diiểm đặc trưng trên

5.2.4 Cách tính mật độ vi sinh vật trên một dưn vị kiểm tr ( gam hay mililit)

Mật độ vi sinh vật trong đơn vị kiểm tra ( A) được tính theo công thức:

trong đó

a - số khuẩn lạc theo yêu cầu có trong hộp lồng

d - nồng độ dịch pha loăng

Chú thích :

1) số lượng khuẩn lạc trung b́nh được tính là trung b́nh cộng số khuẩn lạc của các hộp lồng được cấy từ cùng một độ pha loăng, tong đó chỉ tính các hộp lồng chứa từ 5 đến 50 khuẩn lạc.

2) số lượng khuẩn lạc trung b́nh cũng có thể được tính từ trung b́nh cộng số khuẩn lạc của các hộp lồng được cấy từ hai độ pha loăng kế tiếp nhau bằng cách tính số khuẩn lạc trung b́nh của mỗi độ pha loăng , trong đó số khuẩn lạc ở đó pha loăng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung b́nh cộng của hai giá trị nêu trên nếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 th́ lấy giá trị nỏ làm kết quả.

3) Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10ⁿ, n là số mũ thích hợp.

6.3 .Xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng

6.3.1 Xác định hàm lượng nitơ ( N)

Tiến hành theo TCVN 5815 -1994.

6.3.2 Xác định hàm lượng photpho ( P₂O₅ hữu hiệu)

Tiến hành theo TCVN 5815-1994

6.3.3 Xác định hàm lượng kali ( K₂O)

Tiến hành theo TCVN 5815-1994.

6.3.4 Xác định hàm lượng các chất hữu cơ và vi lưọng

Tiến hành theo các phương pháp và uy định hiện hành

6.3.5 Xác định độ ẩm

Tiến hành theo TCVN 5815-1994

6.4 Báo cáo kết quả kiểm tra

Báo cáo kết quả kiểm tra phải mô tả lại t́nh trạng mẫu trước khi tiến hành kiểm tra( các chi tiết cần và đủ để xác định mẫu), các phương páhp kiểm tra và kết quả đạt được. Báo cáo cũng phải nêu tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tuỳ chọn, cũng như bất kỳ t́nh huống nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

7. Yêu cầu bao gói, ghi nhăn, bảo quản và hướng dẫn sử dụng

7.1 Phân bón vi sinh vật phân giải xenluloza phải được bao gói bằng các chất liệu bảo đảm không gây độc hại tới vi sinh vật, người, động thực vật và môi trường sinh thái, đồng thời đảm bảo thời hạn bảo hành của phân bón trước các điều kiện bất lợ từ bên ngoài.

7.2 Trên mỗi bao ( gói) sản phẩm phân vi sinh vật phân giải xenluloza phải có ghi nhăn với đầy đủ các nội dung sau:

- tên cơ sở sản xuất;

- tên sản phẩm và tên khoa học của loài vi sinh vật sử dụng;

- thành phần dinh dưỡng và độ ẩm;

- công dụng

- ngày sản xuất và thời gian bảo hành

- khối lượng tịnh

- số dăng kư chất lượng

7.3 Sản phẩm phải có bản hướng dẫn sử dụng kèm theo ( in trên bao b́ hoặc in riêng). Nội dung hướng dẫn phải ghi đủ liều lượng và qui tŕnh sử dụng cũng như hiệu quả của phân bón đối với cây trồng hay khả năng thay thế các loại phân bón khác.

PHỤ LỤC A

( Quy định )

A.1 Môi trường nuôi cấy để kiểm tra nấm phân giải xenluloza

Glucoza                                           10,0 g

Pepton                                              5,0 g

KH₂PO₄                                           1,0 g

MgSO₄. 7H₂O                                  0,5 g

Rose bengal                                       33 mg

Streptomycin sunphar  (10%)             3 ml

Aga                                                    20,0 g

Nước cất vừa đủ                                1000 ml

pH                                                     6,5-7,0

A.2 Môi trựng nuôi cấy để kiểm tra vi khuẩn, xạ khuẩn phân giải xenluloza

Peton                                                    5,0 g

Cao thịt ḅ                                           3,0 g

NaCl                                                     5,0 g

Aga                                                      20,0g

Nước cất vừa đủ                             1000 ml

pH                                                     6,8 – 7,0

A.3 Môi trường nuôi cấy để kiểm tra vi khuẩn, xạ khuẩn phân giải xenluloza

Glucoza                                                  1,0 g

K₂HPO₄                                                  0,5 g

Aga                                                        20,0 g

Nước chiết đất*                                    100 ml

Nước cất vừa đủ                                   900 ml

Ph                                                       6,5  -7,0

*Chuẩn bị nước chiết đất:

- 1 kg đất vươn tới + 1 l nước sạch;

- hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp;

- bổ xung 1 g CaCO₃ rồi lọc lấy nước trong.