Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6265:1997 (ISO 6611 : 1992 (E)) về sữa và các sản phẩm sữa - định lượng đơn vị khuẩn lạc nấm men và/ hoặc nấm mốc - kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25oC do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành đã được thay thế bởi Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6265:2007 (ISO 6611 : 2004) về Sữa và sản phẩm sữa - Định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ nấm men và/hoặc nấm mốc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25 độ C .
Nội dung toàn văn Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6265:1997 (ISO 6611 : 1992 (E)) về sữa và các sản phẩm sữa - định lượng đơn vị khuẩn lạc nấm men và/ hoặc nấm mốc - kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25oC do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 6265 : 1997
SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA - ĐỊNH LƯỢNG ĐƠN VỊ KHUẨN LẠC NẤM MEN VÀ/ HOẶC NẤM MỐC - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 25OC
Milk and milk products - Enumeration of colony-forming units of yeasts and / or moulds - Colony-count technique at 25oC
TCVN 6265 : 1997 hoàn toàn tương đương với ISO 6611 : 1992 (E);
TCVN 6265 : 1997 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm của sữa biên soạn, Tổng cuc Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ nấm men và/hoặc nấm mốc nhìn thấy trong sữa và sản phẩm sữa bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25oC.
Phương pháp này có thể áp dụng cho:
- Sữa và các sản phầm sữa dạng lỏng;
- Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát có đông, bột bơ loãng và lactoza;
- Phomát;
- Casein axit, casein lactic, casein rennet;
- Caseinat, bột của dịch sữa axit;
- Bơ;
- Sản phẩm sữa đông lạnh (kể cả kem lạnh thực phẩm);
- Custard, món tráng miệng và váng kem.
Chú thích 1 - Phương pháp này không thích hợp đối với số lượng lớn nấm men không bền nhiệt (trong phomát tươi) Trong các trường hợp như thế, thích hợp hơn là sử dụng phương pháp phủ thạch lên bề mặt.
2. Tiêu chuẩn trích dẫn
ISO 7218 : 1985 Vi Sinh vật học - Hướng dẫn chung về kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) Sữa và các sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh.
ISO 707 : 1985 Sữa và các sản phẩm sữa - Các phương pháp lấy mẫu.
TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725) Độ chính xác của các phương pháp thử nghiệm - Xác định độ lặp lại và độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn bằng các phương pháp thử của liên phòng thí nghiệm.
3. Định nghĩa
Áp dụng định nghĩa sau đây trong tiêu chuẩn này:
3.1. Nấm men và nấm mốc - Các vi sinh vật ở 25oC, dưới các điều kiện qui định trong tiêu chuẩn này tạo thành các khuẩn lạc.
4. Nguyên tắc
4.1. Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc và một lượng mẫu thử xác định nếu như sản phẩm dạng lỏng, hoặc huyền phù ban đầu khi sản phẩm dạng khác.
Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, với các dung dịch pha loãng thập phân hoặc huyền phù từ mẫu thử.
4.2. Nuôi ấm các đĩa 5 ngày, ở 25oC, trong môi trường có không khí.
4.3. Tính số đơn vị khuẩn lạc tạo thành (CFU) của nấm men và/hoặc nấm mốc trong 1 gam hoặc trong 1 mililít sản phẩm từ số khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn ở các độ pha loãng sao để có được kết quả đúng.
5. Chất pha loãng và môi trường nuôi cấy
5.1. Khái quát
Hướng dẫn chung, xem ISO 7218.
5.2. Nguyên liệu chính
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989)
5.3. Chất pha loãng dùng cho các mục đích chung
Xem TCVN 6263 : 1997 (lSO 8261 : 1989).
5.4. Chất pha loãng dùng cho các mục đích riêng biệt
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 19S9).
5.5. Phân phối, khử trùng và bảo quản chất pha loãng
Xem TCVN 6263 : 1997 (lSO 8261 : 1989).
5.6. Môi trường cao men/ dextroza / oxitetraxiclin/ thạch
5.6.1. Môi trường cơ bản
5.6.1.1. Thành phần
Bột cao men 5,0 g Dextroza (C6H12O6) 20,0 g Thạch 10 g đến 15 g1) Nước 900 ml |
1) Tuỳ theo độ đông của thạch |
5.6.1.2. Chuẩn bị
Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 6,6, ở 25oC.
Khử trùng bằng hấp trong nồi hấp áp lực (6.1 ) ở 121oC ± 1oC khoảng 15 phút.
5.6.2. Dung dịch oxitetraxiclin
5.6.2.1. Thành phần
Oxitetraxiclin hidroclorua (C22H30N2O11) . HCl 50 mg Nước 50 ml |
6.2.2. Chuẩn bị
Hoà tan oxitelraxiclin trong nước. Chuẩn bị dung dịch mới trước mỗi lần sử dụng. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc.
5.6.3. Môi trường hoàn chỉnh
5.6.3.1. Thành phần
Oxitetraxiolin hidroclorua 10 ml Môi trường cơ bản 90 ml |
5.6.3.2. Chuẩn bị
Làm nguội môi trường cơ bản đã khử trùng (5.6.1) tới 45oC. Ngay trước khi sử dụng, đưa dung dịch oxitetraxiclin (5.6.2) về 45oC và cho 10 ml dung dịch này vào 90 ml môi trường cơ bản.
5.7. Môi trường cao men / dextroza / cloramphenicol / thạch
5.7.1. Thành phần
Bột cao men 5,0 g Dextroza (C6H12O6) 20,0 g Cloramphenicol (C11H22Cl2N2O5) 0,1 g1) Thạch 12 đến 15 g2) Nước 1000 ml |
1) Để thu được nồng độ cuối cùng của môi trường là 100 mg/ml. 2) Tuỳ theo độ đông của thạch. |
5.7.2. Chuẩn bị
Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.
Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,6, ở 25oC. Phân phối môi trường thạch vào các hộp đựng thích hợp (6.8).
Khử trùng bằng hấp trong nồi hấp áp lực (6.1), ở 121oC ± 1oC 15 phút .
6. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh
Chú ý - Phải khử trùng tất cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, chất pha loãng, dung dịch pha loãng, hoặc tiếp xúc với môi trường nuôi cấy phù hợp với TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), (6.1).
Chú thích 3 - Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thuỷ tinh sử dụng nhiều lần, nếu như nó phù hợp với các yêu cầu qui định.
Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử và các dung dịch pha loãng theo qui định của TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) và đặc biệt là:
6.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp), xem ISO 7218.
6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 25oC ± 1oC.
6.3. Đĩa Petri, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.
6.4. Pipet chia độ, được nhét nút bông, đã hiệu chỉnh dung tích 1 ml ± 0,02 ml hoặc 10 ml ± 0,2 ml hoặc 11 ml ± 0,2 ml.
6.5. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động ở 45oC ± 1oC.
6.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm một bộ phận chiếu sáng có nến đen, được gắn với kính lúp có độ khuếch đại 1,5 lần và có một dụng cụ đếm cơ hoặc điện tử.
6.7. pH mét bù nhiệt, chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH, ở 25oC.
6.8. Chai hoặc bình để nuôi cấy mẫu
Chú thích 3 - Có thể dùng chai hoặc bình có nắp xoáy, bằng kim loại không độc.
7. Lấy mẫu.
Lấy mẫu theo ISO 707.
Chú thích 4 - Khi phomát đã phủ kín nấm men và nấm mốc thì phải loại bỏ lớp phủ khỏi mẫu thử. Trog những trường hợp như thế phải dùng dao đã khử trùng để cắt bỏ lớp vỏ trước khi lấy mẫu.
8. Cách tiến hành.
Chú thích 5 - Để tăng độ chính xác của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cẩn thận. Những yếu tố tác động đến độ chính xác là:
- Kiểu loại thiết bị khuấy trộn;
- Thời gian khuấy trộn:
- Chất pha loãng:
- Thời gian để cho các hạt to lắng xuống;
- Thời gian trộn cho phép khi chuẩn bị các dung dịch loãng thập phân.
Chú ý - Phải thực hiện các thao tác vô trùng thông thường. Những thao tác qui định trong 8.1 và 8.2 không được tiến hành dưới ánh nắng mặt trời.
8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).
8.2. Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Xem
TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).
8.3. Thời gian tiến hành
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989); 8.3.
8.4. Cấy và nuôi ấm
8.4.1. Lấy hai đĩa Petri (6.3) vô trùng. Dùng một pipet vô trùng (6.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử, nếu là dạng lỏng, hoặc 1 ml chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác.
8.4.2. Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng.
Dùng một pipet vô trùng khác, cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10-1 (sản phầm ở dạng lỏng), hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10-2 (sản phầm ở dạng khác).
8.4.3. Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.
8.4.4. Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường chứa oxitetraxiclin (5.6), hoặc môi trường chứa cloramphenicol (5.7) đã được làm cho nóng chảy từ trước và giữ ở 45oC trong nồi cách thủy (6.5).
8.4.5. Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt các đĩa Petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát.
8.4.6. Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy với môi trường không được vượt quá 15 phút.
8.4.7. Chuẩn bị đủ số đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng.
8.4.8. Lật ngược các đĩa đã cấy xong (8.4.5) và đặt chúng vào tủ ấm (6.2) 4 ngày, ở nhiệt độ 25oC.
Chú thích 6 - Để tránh hiện tượng lan rộng cần phải để phòng như sau:
- Phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên trên mặt các đĩa đã cấy sau khi đã đông đặc, hoặc
- Nhỏ thêm một giọt glixerol lên trên giấy lọc của nắp đĩa.
8.4.9. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau, cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm.
8.5. Đọc kết quả
8.5.1. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa; tránh đếm nhầm các khuẩn lạc mọc bất thường. Nếu cần, phân biệt các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc dựa trên cơ sở đặc tính hình thái sinh vật. Xem 8.6.
8.5.2. Chỉ giữ lại các đĩa có từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Nếu các phần của đĩa bị nấm móc che phủ; hoặc nếu khô có thể đếm các khuẩn lạc riêng biệt, thì đếm các khuẩn lạc trong các đĩa có độ pha loãng cao hơn tiếp theo, thậm chí số khuẩn lạc đó có thể ít hơn 10. Trong trường hợp như thế tiến hành theo 9.2.
8.6. Khẳng định
Phân biệt các chấm đen hoặc các khuẩn lạc nghi ngờ bằng cách kiểm tra qua kính hiển vi. Nếu cần, khẳng định ít nhất là 
các khuẩn lạc xác định bằng kính hiển vi, trong đó n là số khuẩn lạc đếm được.
9. Biểu thị kết quả
9.1. Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 150 khuẩn lạc.
Tính số CFU của nấm mốc và / hoặc nấm men, N , trong 1 gam hoặc trong 1 mililít sản phẩm, theo công thức:
Trong đó
N = 
∑c là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại;
n1 là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc; n2 là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc;
d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Chú thích 7 - Nếu có nhiều hơn hai độ pha loãng có thể đếm được, cho kết quả từ 10 đến 150 khuẩn lạc thì công thức phải được sửa đổi, có tính đến những độ pha loãng tiếp theo đó. Với ba độ pha loãng thì theo công thức:
N = 
Trong đó
N3 là số đĩa của độ pha loãng thứ 3 được giữ lại, có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc.
Làm tròn số kết quả thu được đến 2 chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn là 5 mà không có chữ số có nghĩa nào đứng theo sau thì làm tròn số đúng trước chữ số 5 cho thành số chẵn. Thí dụ:
28.500 làm tròn thành 28.000, và 11.500 được làm tròn thành 12.000.
Lấy kết quả là số CFU nấm mốc và / hoặc nấm men có trong 1 mililít hoặc trong 1 gam sản phẩm, biểu thị bầng số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10.
Thí dụ:
Việc đếm khuẩn lạc CFU của nấm men và/ hoặc nấm mốc cho kết quả sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng đã được ủ):
- Độ pha loãng thứ nhất (10-2) được giữ lại chứa 83 và 97 khuẩn lạc
- Độ pha loãng thứ hai (10-3) được giữ lại chứa 33 và 28 khuẩn lạc
N = 
Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên (9.1) thu được 11.000 hoặc 11 x 104 CFU của nấm men và / hoặc nấm mốc có trong một gam, hoặc một milillt sản phẩm.
9.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau:
- Ít hơn 10 CFU của nấm men và / hoặc nấm mốc có trong một mililít (sản phẩm lỏng)
- Ít hơn 10 x 1/d CFU của nấm men và / hoặc nấm mốc có trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của chất huyền phù ban đầu.
9.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 150 khuẩn lạc thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 150 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của hệ số pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc CFU nấm men và / hoặc nấm mốc ước tính trong một gam hoác một mililít sản phẩm”
10. Độ lặp lại
Độ chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm, dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá 30% của kết quả thấp hơn.
Chú thích
8) Nếu các trường hợp không thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại là 5%, hoặc lớn hơn thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng gây ra sai lỗi.
9) Định nghĩa về độ lặp lại xem TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725).
11. Báo cáo kết quả
Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng, kết quả thử nghiệm thu được và phương pháp biểu thị đã sử dụng. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tuỳ ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.
Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đấy đủ mẫu thử.
